Desmond Miles, un barman secuestrado por los templarios en el año 2012, consigue huir de la prisión de Abstergo gracias a Lucy Stillman, una asesina actual. Tras un par de peleas con los guardias de Abstergo, escapan en un coche hacia al refugio de los asesinos. Allí, como en Abstergo, los asesinos poseen un Animus, una máquina que permite conocer la vida de tus antepasados volviendo a su época. Esta vez, Desmond se transporta al Renacimiento, donde conoce a su antepasado, Ezio Auditore Da Firenze. Ezio Auditore Da Firenze, un joven italiano que vivía la dolce vita a sus 17 años, se encuentra en un momento trágico de su vida, cuando las familias "amigas" de los Auditore conspiran contra su familia y consiguen encarcelarla. Ezio logra hablar con su padre, Giovanni Auditore, banquero de la ciudad y asesino en secreto, en la cárcel, y le ordena que vaya a su casa, descubra una habitaci n contigua y secreta y se apropie de todo lo que encuentre allí. Ezio descubre en la habitación un baúl que contiene una vestimenta de asesino, una espada y una hoja rota del credo asesino, que más tarde Leonardo Da Vinci reparará. Sin embargo, no consigue impedir que asesinen a su padre y a sus dos hermanos, Federico y Petruccio.
